| Språk : |
|
| Encyclopedia gemenskap |Encyclopedia Svar |Submit fråga |Ordförråd Kunskap |Överför kunskap |
Polymeraskedjereaktion |
  |
|
Fem. Dimetylsulfoxid (DMSO) i en PCR utförs med användning av Klenow-fragmentet av DMSO är användbara, att lägga till 10% DM-SO bidrar till att minska den sekundära strukturen av DNA, den (GC)% halt lätt att fullständigt denaturerad mall, reaktionen DMSO tillsätts till systemet att vara mer direkt sekvensering av PCR-produkter, men mer än 10% kommer att inhibera aktiviteten av Taq DNA-polymeras, så de flesta använd inte DMSO.Fyra typer av deoxi nukleotidtrifosfat (4 × dNTP) I PCR-reaktionen, kommer den slutliga koncentrationen av dNTP över 50 mmol / L hämmar aktiviteten av Taq DNA-polymeras, med låga dNTP koncentrationer av icke-mål-läge kan reduceras vid start nukleotid felinkorporering och förlängning, lätt att producera höga koncentrationer av dNTP felinkorporering, Koncentrationen är för låg, är skyldig att minska produktionen av reaktanterna. PCR används en koncentration av 50 ~ 200μmol / L, är inte mindre än 10 ~ 15μmol / L. Fyra typer av dNTP koncentration bör vara samma som någon av en hög eller låg koncentration kommer att inducera polymeras felinkorporering, reducerad synteshastigheten, förtid avsluta reaktionen. Faktorer som påverkar de minsta dNTP koncentrationen av sekvenser mål-DNA i längd och sammansättning, till exempel, reaktionen systemet i 100 4 × dNTP användas om koncentrationen av 20μmol / L, i princip uppfylla 2.6μg DNA-syntes eller 10 pmol av 400 bp sekvens. 50μmol / L av 4 × dNTP kan syntetiseras 6.6μgDNA och 200μmol / L tillräcklig syntes 25μg/DNA. DNTP lösning köpt från leverantörer allmänhet justerades pH, var tillämpningen av 1 mol / l NaOH dNTP stamlösning pH justerat till 7,0, för att säkerställa att pH för reaktionen är ej mindre än 7,1. Kommersiellt tillgängliga fria nukleotider frystorkat pulver, upplöst användning NaOH och sedan UV-spektrofotometer kvantifiering. Mängden primer Primer koncentration i PCR-reaktionen är i allmänhet 0,1 ~ 1μmol / L mellan. Lätt att bilda en hög koncentration av primerdimerer och icke-specifik genererade produkter. Generellt ekonomi med låga koncentrationer av primers, specifika, men koncentrationen är för låg för att slutföra 30 amplifieringscykler reaktionen PCR avkastningen minskar. Mängden TaqDNA polymeras En typisk PCR-reaktionsblandning, koncentrationen av enzymet 2.5U/μl, sträcker sig vanligen från 1 ~ 4U/100μl. Eftersom olika DNA-mall och primers är olika, skillnader och andra förhållanden, det finns skillnader i mängden polymeras, kan enzymet leda till överdriven ökning av icke-specifika produkter. Som tillverkare av krafterna formel militär, produktionsförhållanden, och den typ av verksamhet definieras, olika tillverkarna har olika prestanda TaqDNA polymeras. Cetus Corporation enzym definieras som: ett enzym enhet definieras i följande analytiska betingelser, vid 74 ℃, 30min 10nmmol av dNTP inbyggnad syraolösliga komponent av enzymet behövs. Mätning är 10min, 30min omvandlas till inkorporering. Analys villkor 25nmol / L TAPS (trihydroxi - metyl - amino propansulfonat pH9.3.25 ℃), 50 mmol / l KCl, 2 mmol / L MgCl2.1mmol / L β-ME (merkaptoetanol), dATP, dTTP, dGTP vardera 200 mmol / L, var dCTP 100 mmol / L (från att inte märkning och α-32P märkt blandat), 12.μg denaturerad sillsperma DNA, slutlig volym på 50 pl. Mall Single-, kan dubbelsträngat DNA eller RNA användas som PCR-prov. Om utgångsmaterialet är RNA, måste först ta sig igenom den första omvänt transkriptas-cDNA. Även om endast en mycket liten mängd av PCR-prov kan, även från en enda cell-DNA, men att säkerställa specificitet, men också tillämpningsnivån kloning ng DNA, ig nivå av en enda kopia eller 104 kopior av det kromosomala DNA-fragmentet som skall amplifieras som utgångsmaterial, kan mallen vara rå, men inte blandat med någon proteas, nukleas, Taq DNA polymerashämmare, och DNA-bindande proteiner. DNA-storlek är inte den avgörande faktorn, men med mycket hög molekylvikt DNA (t.ex. genomisk DNA) som krävs av ultraljudsbehandling eller användning av en sällsynt restriktionsenzym cut-led (t.ex. Sal1 och Not1) första matsmältning, PCR-resultaten bättre. Closed loop av DNA målsekvens amplifieringseffektiviteten något lägre än linjärt DNA, alltså, som en reaktion mall plasmid bästa första raden i sin. Koncentrationen av målsekvensen mallen kan variera, ofta styrd av icke-laboratoriepersonal, laboratorium enligt känd målsekvens minus mängden inversa metoder (1 ng, 0,1 ng, 0.001ng, etc.), inrätta en grupp av kontrollreaktioner att upptäcka förstärkning känslighet av svaret för att uppfylla kraven. Paraffinolja PCR-amplifiering rekommenderar det översta lagret av blandningen av paraffinolja, vilket minskar PCR-processen, speciellt när variabilitet på grund av avdunstning av den flytande produkten går förlorad. Studier har visat att tillämpningen medger förstärkning av paraffinolja produktionen ökade fem gånger mer benägna att behålla termisk konstant med paraffinolja och salt för hela reaktionen systemet. Elektrofores I praktiken, ofta med hjälp av agarosgelelektrofores. Vanligtvis den första i elektroforesbuffert eller gel plus 1% etidiumbromid (EB) (per 100ml tillägg 100 pl), och kommer att ha beretts av 1% till 2% agaros gel (elektroforesbuffert beredning ) i elektrofores tank, tillsätta provet 10 pl, samtidigt med molekylviktsstandarder för taggar. DNA-fragment separerades genom agaroskoncentration bör väljas storlek, i allmänhet 1,5% till 2%, elektrofores spänning 75V, de gelproverna fram till slutet av 1cm från gelén, stänga av strömmen, ta bort gelen resulterar direkt betraktas i ultraviolett ljus . Etidiumbromid kan användas med det dubbelsträngade DNA för att bilda konjugatet, kan avge fluorescens under UV-ljus, fluorescensintensiteten hos EB 80 till 100 gånger, så gelén efter elektrofores direkt kan observeras under ultraviolett ljus. Vanligtvis är mängden DNA visuellt observerades upp till 10 ng, är fluorescensintensiteten proportionell mot DNA-innehåll. DNA-molekyler i gelén rörlighet takt som bestäms av laddningen effekt och molekylära effekter. Den tidigare belopp som bestäms av nettoladdningen, medan den senare med molekylstorlek och konfigurationsinformation. DNA-molekyler efter storlek, till gelkoncentrationen göra olika justeringar. Laboratorieförhållanden kan också användas polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)-analys av det amplifierade DNA-fragmentet. De viktigaste faktorerna som påverkar PCR PCR-teknik måste ha en rimlig syntetiska primers och det extraherade provet DNA, innan du utför automatisk termisk cykling, var den slutliga produkten identifieras och analyseras. Primer design och syntes finns för närvarande endast ett fåtal stark teknisk kraft och Forskningsinstitut, bedrivs klinisk applikation bara köpa PCR Detection Kit kan arbeta, PCR automatisk termisk cykel många faktorer av olika DNA-prover, PCR olika ingredienser som tillsatts till reaktionsvolymen och temperaturcykling parametrar var inkonsekvent. Nu flera huvudfaktorer beskrivs nedan. I. temperatur cykelparametrarna Automatisk värmecykling i PCR, är den mest kritiska faktorn temperaturen för denaturering och annelering. Som visas i exemplet drift, denaturering, hybridisering och villkor förlängning: 94 ℃ 60, 37 ℃ 60s, 72 ℃ 120s, på 25 till 30 cykler, förstärkta fragment 500 bp. Här bör tiden för varje steg vara att uppnå den erforderliga reaktionsblandningen temperatur räknas. Inom den automatiska termocykler från den ursprungliga blandningen till önskad temperatur blir temperaturer den tid som krävs 30 ~ 60s, fördröjningstiden beror på flera faktorer, inklusive typ av reaktionsröret, väggtjockleken, volym av reaktionsblandningen, en värmekälla ( vattenbad eller värmeblock), och temperaturskillnaden mellan två steg, bör de termiska cykler helt rest uppmärksamhet och hänsyn, skall mätas för varje instrument. Cykeltid på Thermal En annan viktig faktor är avståndet mellan de två primers, avstånd längre, är syntetisk mål sekvenslängd längre tid som krävs, är ovanstående reaktion tid som ges av den sammanlagda längden av 500 bp för föreslås målsekvens. Här valet av en mängd olika temperatur som en introduktion. Ett. Template denatureringstemperaturen är temperaturen i denaturering av dubbelsträngad DNA PCR-reaktion smälttemperatur, mindre än denatureringstemperaturen inte genererar enkelsträngad DNA mall, kommer PCR startar inte. Denatureringstemperaturen är låg då denatureras ofullständiga, DNA dubbel-strängen snart vika, vilket minskar avkastningen. Generellt tar 90 ~ 95 ℃. När proverna anländer vid denna temperatur bör kylas snabbt till glödgningstemperaturen. DNA denaturering bara några sekunder, är det dags för länge är inte nödvändigt, tvärtom bör det hög tid vara så kort som möjligt för att bibehålla vitaliteten i Taq DNA-polymeras, var Taq DNA-polymeras tillsätts efter denatureringstemperaturen inte bör överstiga den högsta 95 ℃. 2. Primer glödgningstemperatur glödgningstemperaturen bestämmer PCR specificitet och utbyte; temperatur hög specificitet, men alltför hög fast primer och mallen kan inte kombineras, minskad DNA-amplifiering effektivitet, låg temperatur, hög avkastning, men för låg kan orsaka en obalans med mallen primer , icke-specifika produkter ökar. Generellt först startas vid 37 ℃ betingelser, sätta en serie av kontrollreaktioner, i syfte att avgöra om en viss och den optimala glödgningstemperaturen. Också baseras primer (GC)% halt av spekulation, som börjar att ta tag i testet, det allmänna testet amplifieringsprimern glödgningstemperaturen högre än smälttemperaturen lägre TTM 5 ℃, beräknas enligt formeln: Ta = Tm -5 ℃ = 4 (G C) 2 (A T) -5 ℃ |
| Användare Omdöme |
|
Inga kommentarer |
