| Språk : |
|
| Encyclopedia gemenskap |Encyclopedia Svar |Submit fråga |Ordförråd Kunskap |Överför kunskap |
Polymeraskedjereaktion |
  |
|
Teknik definitioner Kinesiska Namn: polymeras kedjereaktion Engelska namn: polymeras kedjereaktion, PCR Definition: Ett DNA-fragment amplifieras in vitro viktig teknologi. Om förekomst av DNA-mallen, substrat, uppströms och nedströms primers och termostabilt DNA-polymeras när, efter flera "denaturering - renaturerings - förlängning reaktion" cykel process, spåra mall-DNA kan förstärkas till flera hundra gånger.Applied Science: biokemi och molekylärbiologi (ett ämne), metoder och tekniker (två personer) Ovanstående innehåll av National Science and Technology Approval kommitté meddelade Polymeraskedjereaktion eller polymeraskedjereaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), även känd som cell-kloningsteknik ("fria bakterier" kloningsteknik), är en typ av specifika DNA-fragment in vitro snabb amplifiering av den nya metoden. 1985 amerikanska PE-Cetus Corporation och andra mänskliga genetisk forskning av Mullis uppfann landmärke polymeraskedjereaktionen. Denna metod är en förändring i det traditionella mönstret för molekylär kloning, inte genom levande celler, lätt att använda, inom några timmar kan göra flera kopior av templatsekvensen amplifiering av en DNA-molekyl eller ens 10 ^ 7 till 10 ^ 8 gånger, kraftigt förbättra DNA utbyte av. Har i stor utsträckning till molekylära fält biologiforskning. Disposition PCR-tekniken utvecklades i mitten av 1980-talet in vitro nukleinsyraförökning teknik. Den har en specifik, känslig, hög avkastning, snabb, enkel, reproducerbar, enkel automatisering och andra fördelar. Cetus PCR-teknik först föreslogs av det amerikanska bolaget Human Genetics Kary Mullis och kollegor upptäckte 1985 och framgångsrikt utvecklat, tidigaste ansökningar Saiki et al 1985 rapporterade att PCR-tekniken i β-globin förstärkning och sicklecellanemi fosterdiagnostik. Chien 1976 använder sedan den termiska stabiliteten hos ett sådant isolerat Taq DNA-polymeras i hög grad förenklar PCR-protokollet och göra det möjligt att automatisera PCR; 1987 Kary Mullis kompletta automationslösningar anordningar såsom, för praktisk användning av PCR-tekniken. Fudan University sedan 1988 började utveckla värmetåligt polymeras, Militär medicinska vetenskaper professor Ma Liren, etc. 1989 framgångsrikt utvecklat PCR automatisk anordning, och innovation, som nyligen utvecklats av PTC-51A / B-typ DNA-thermocykelapparat liten storlek, tilltalande utseende , prisvärd, lätt att använda, är det särskilt lämpligt för hemmiljöer. PCR uppfann mindre än 10 år, de är allmänt tillgängliga. Varje år tusentals artiklar publicerade. 1991, tidskriften "PCR Methods and Applications" (PCR metoder och tillämpning) grundades i USA, så att de lärda har ett eget forum och referens facktidskrifter. PCR-teknik som en metodologisk revolution, kommer att kraftigt främja de relevanta discipliner av molekylärbiologisk forskning, för att nå en ny höjd. 1993 års Nobelpris i kemi kommer att tillkännages den 13 oktober var, Kary Mullis för hans uppfinning av "polymerase chain reaction" och att få denna utmärkelse. Nu över hela världen i blodet hos patienter med PCR detektion av spår genetiskt material, en bedrift för korrekt diagnos av aids och andra sjukdomar, vilket banar väg. Kungliga Svenska Vetenskapsakademien sade: "PCR-metoden har i stor utsträckning använts i biomedicin Denna metod i kombination med DNA-sekvensering är sannolikt att bli ett forsknings djur och växter taxonomi av ett innovativt verktyg.." En kanadensisk, brittisk vetenskapsman Michael Smith skapade grund den "oligonukleotid mutagenes" närma sig detta med Mullis dela härligheten. Princip PCR är den enzymatiska syntes av specifika DNA-fragment in vitro ny metod, främst genom den höga temperaturen denaturering, hybridisering, och den optimala temperaturen låg förlängningssteg av upprepade termiska cykler tre komponenter: den höga temperaturen (95 ℃), det dubbelsträngade mål-DNA som skall amplifieras värmedenaturering två enkelsträngad DNA-mall och sedan vid en låg temperatur (37 ~ 55 ℃) fall, de två syntetiska oligonukleotid-primer komplementär till den enkelsträngade DNA-mallen och bildar en partiellt dubbelsträngad, i Taq DNA-polymeras optimal temperatur (72 ℃) under primer 3'-änden av utgångspunkten för syntes av, som råvara i en enda nukleotid utmed mallen 5 '→ 3'-riktningen, en ny syntetisk DNA-kedja (på grund av hög temperatur reaktion, Därför måste polymeraset som används i reaktionen vara termostabilt DNA-polymeras). Så att varje dubbelsträngat DNA-templat, efter en smältning, glödgning och töjning efter tre-stegs termisk cykel i två dubbel-DNA-molekyl. Detta upprepas varje cykel kan genereras från en DNA-mall för nästa cykel, varje cykel är de två syntetiska DNA-primers specifika regionen mellan det dubbla antalet kopior förstärkning, kan PCR-produkter vara 2n antal satser form av snabb expansion, efter 25 till 30 cykler, teoretiskt möjligt genförstärkning 109 gånger mer, i själva verket, i allmänhet upp till 106-107 gånger. DNA består av fyra komplementära basparning enligt principen (dvs., adenin, tymin Ett par T, G för guanin, cytosin C) bestående av en dubbelsträngad helix. I cellen, DNA-replikering, en dubbelsträngad helikas låsa upp den först som en mall till enkelsträngar, och sedan en annan enzym - RNA-polymeraser korta primers (primer) bindning till DNA-mallen, Slutligen DNA syntas med denna primer som utgångspunkt, syntes och DNA-mall matchande nya kedjor. PCR som är DNA-replikation in vitro process som tillåter användning av uppvärmningsorgan denaturerade DNA-fragment till en enda två-kedja, två primrar syntetiserades så att de binder till båda ändarna av DNA-mallen, DNA-polymeras, som kan vara bulk kopiera mallen. Förutsatt amplifieringseffektiviteten var "X", det antal cykler "n", är både de förstärkningsfaktorn "y" kan uttryckas som förhållandet: y = (1 X) n. 30 amplifieringscykler som är n = 30, om X = 100%, då y = 230 = 1073741824 (> 109), och om X = 80%, då y = 1.830 = 45517159,6 (> 107). Således är förstärkningsfaktorn enorma, var PCR-produkten utsattes för elektrofores, kan etidiumbromidfärgning, UV-bestrålning kök (254 nm) i allmänhet ses ett specifikt amplifierade DNA-band. Reaktion PCR Operation Exempel PCR basic schema (visas till höger): I en typisk PCR-reaktion för att vara extra: Lämpliga buffertar, små mängder av DNA-templat, 4 × dNTP värmetåligt polymeras, Mg2 och två syntetiska primers DNA. Mall-DNA 94 ℃ denaturering 1min, primerhybridisering mall 40 ~ 60 ℃ 1min, 72 ℃ förlängning 2min. I den första cykeln innan mallen denaturering 3 ~ 5 min, under den senaste cykeln, proverna måste fortsätta att utöka mer än 3 ~ 5min för att säkerställa den förstärkta DNA är dubbelsträngat DNA. PCR-reaktionen är lätt att förstå sammansättningen av varje komponent tillsattes och reaktionsbetingelser som gör det som grund, föremål för olika undersökningar för att hitta den bästa genom att ändra reaktionsförhållandena innefattar speciellt företag Perkin Elmer Cetus Gene Amp DNA-kit Typiska reaktionsbetingelser anges som referens. Sammansättning av PCR reaktionssystemet PCR-buffert (PCrBuffer) Standard buffert för PCR ser PCR operativsystem paradigm. Vid 72 ℃, kommer pH för reaktionssystemet släppa en enhet, nära 7,2. Förekomsten av tvåvärda katjoner avgörande inflytande PCR specificitet och avkastning. Experiment visar att, Mg2 än Mn2, och Ca2 ingen effekt. Ett. Den optimala koncentrationen av Mg2 koncentrationen av Mg2 1,5 mmol / L (när koncentrationen av varje dNTP var 200 mmol / L), i mallen men inte någon form av kombination av primer är bäst. Första gången med målsekvensen och primern när Mg2 koncentration inställdes att vara optimal, koncentrationsområdet av en ~ 10 mmol / L. Mg2 lätt att generera ett överskott av icke-specifika PCR-produkter, Mg2 mindre lätt att göra utbytet. Närvarande i provet desto högre koncentration av kelaterande medel såsom EDTA eller en hög koncentration av negativt laddade grupper såsom fosfatjoner, Mg2 kombination med reducerande den effektiva koncentrationen av Mg2. Därför skall användas som en mall-DNA löstes i 10 mmol / l Tris-HCl (pH 7,6) 0,1 mmol / L EDTA i. dNTP innehållande fosfat, kommer koncentrationen av Mg2 förändring påverkar den effektiva koncentrationen. Standard reaktionssystemet 4 × dTNPs total koncentration av 0,8 mmol / L, mindre än 1,5 mmol / L koncentrationen av Mg2. Således, DNA och dNTP-koncentrationen i hög kondition att koncentrationen av Mg2 justeras därefter. 2. Tris-HCl-buffert som användes i PCR-10 ~ 50 mmol / L av Tris-HCl-buffert, sällan använda övriga typerna av buffertar. Tris-buffert är en dubbel-polariserad jonisk buffert, är pKa 8,3 (20 ℃), △ pKa 0,021 / ℃. Därför, 20 mmol / l Tris pH 8,3 (20 ℃) när, i en typisk termisk cykelbetingelser, den sanna pH-värde mellan 7,8 till 6,8. Tre. K koncentration av KCl koncentration av 50 mmol / L NaCl för att främja primerhybridisering. Men studier visar att, kommer NaCl koncentration av 50 mmol / L NaCl, KCl koncentrationer högre än 50 mmol / L undertrycka aktiviteten hos Taq DNA-polymeras, och mindre med eller utan KCl PCR resultaten inte påverkas nämnvärt. 4. Gelatin och gelatin BSA eller nonjonisk detergent som har en stabilt enzym. Allmänt mängd 100μg/ml, men nu forskning visar att med eller utan kan få en bra och PCR resultat har liten effekt. |
| Användare Omdöme |
|
Inga kommentarer |
